优化甲基杆菌发酵法产麦角硫因
摘 要：麦角硫因(Ergothioneine, EGT)凭借其独特的抗氧化性在食品、药品、化妆品、医疗卫生等方面应用广泛。甲基杆菌可以将廉价的甲醇转化为更具商业价值的EGT。前期研究表明，甲基杆菌发酵合成EGT产量很低。为提高EGT产量，试验以甲基杆菌为研究对象，采用适应性进化方法获得耐高浓度甲醇菌株，利用EGT特征吸收峰的方法高效地筛选出常压低温等离子体诱变后的EGT高产突变菌株。同时，优化并确定最优菌株培养条件和发酵过程。最后，将甲基杆菌中EGT合成基因外源导入大肠杆菌中，将改造后的菌株进行发酵验证EGT产量，侧面验证甲基杆菌中EGT合成基因的催化能力。结果表明，M.oryzae-336在优化后产量最高达到35.6 mg/L，较同一条件下原始菌株EGT产量提高48.9%。
关键词：菌种选育；发酵工艺；甲基杆菌；麦角硫因
麦角硫因 (Ergothioneine, EGT)是一种天然手性氨基酸，是天然的抗氧化剂，具有清除体内自由基，维持体内氧化还原平衡等功能[1]，能够维持DNA的生物合成、维持细胞正常生长、维持细胞免疫功能等，是机体内重要的活性物质[2]。EGT因具有超强的抗氧化能力在众多与细胞内氧化还原反应相关的疾病治疗中发挥重要作用。EGT不仅具有较高的氧化自由基吸收能力同时具有较好的生物利用度[3]，可以抑制氧化损伤[4]，可对紫外线照射导致的细胞DNA损伤进行修复[5]，抑制细胞凋亡的发生，并使细胞活力增加[6]。
麦角硫因在多种微生物中均有合成，包括麦角菌[7]、分枝杆菌[8]、甲基杆菌[9]、蘑菇[10, 11]等，然而EGT在微生物中天然合成的产量均不高，尤其在细菌中，产量约为0.2-3.0mg/g细胞干重[12]，EGT产量最高的微生物为蘑菇，Kalaras等最新研究表明，蘑菇中牛肝菌属的麦角硫因含量达到7.27 mg/g细胞干重[13]。当前EGT生产的主流方法为以蕈菌发酵生产，且已经实现工业化[14]。但由于蕈菌不易进行分子改造，生长缓慢，发酵周期长等缺点导致制造成本高，麦角硫因的推广和应用受到限制。
研究表明，甲基杆菌(Methylobacterium oryzae)可将甲醇作为唯一碳源通过发酵合成EGT[15]，把廉价的甲醇转变为更具商业价值的产品，这是其区别于其他微生物的最大的特点，解决了微生物发酵工业与人争粮的问题，同时也可以解决大量甲醇带来的污染问题[16]。然而高浓度的甲醇对细胞生长具有毒性作用[17]，甲基杆菌的最适甲醇浓度为30g/L，甲醇浓度达到40 g/L时会使甲基杆菌生长受到抑制，50g/L的甲醇浓度会完全抑制其生长[18]。因此为了提高碳源供给，使其可以耐受更高浓度的甲醇，试验采用实验室适应性进化的方式对菌株进行驯化，在高浓度甲醇条件下对菌株进行连续传代培养，逐步提高菌株的耐受甲醇能力，得到耐受高浓度甲醇的菌株，为进一步工艺改造提供基础。
本研究[19]的主要目的在于获得EGT高产菌株，提高甲基杆菌生产EGT的发酵水平。因此试验对原始菌株进行适应性进化育种和诱变育种对菌株进行耐受性和EGT高产特性改造，通过发酵培养基和发酵工艺优化获得最适发酵条件。此外，为进一步验证甲基杆菌生产ETG的能力，将甲基杆菌中EGT合成基因外源导入大肠杆菌中，通过凝胶电泳检验基因的表达情况，将改造后的菌株进行发酵验证EGT产量，侧面验证甲基杆菌中EGT合成基因的催化能力。
1 麦角硫因合成菌株代谢改造案例
鉴于微生物中EGT的合成产量都很低，因此通过代谢改造来提高EGT产量是当前研究热点。代谢改造通常包括以下几种方式：过表达合成关键基因且敲除竞争途径基因，Tani等在甲基杆菌中发现了麦角硫因合成基因EgtABCDE，并确定EgtBD为关键基因，通过对其进行过表达，使麦角硫因在甲基杆菌中的产量从0.65 mg/L提高到1.3 mg/L，随后又敲除组氨酸裂解酶阻断EGT前体物质组氨酸的分解，使组氨酸更多的用于EGT合成，通过改造使EGT产量进一步提高到2.5mg/L，较原始产量提高约4倍[20]；选取简洁高效的合成路线对菌株进行重构，通过分析EGT在真菌和细菌中的不同合成路径，可以发现在真菌中的合成路线更简洁高效且能解除谷胱甘肽的竞争途径，Takusagawa等在对米曲霉菌以及粗糙脉孢菌中的麦角硫因合成基因进行分析后，通过在米曲霉菌中导入来自粗糙脉孢菌中的Egt1和Egt2基因，使米曲霉菌中EGT产量提高近20倍，达到231.0mg/kg[21]；第三种策略是鉴于原始菌株代谢过程的复杂性，选取代谢途径简单的菌株进行表达路径重构，一般选取大肠杆菌作为宿主细胞，通过外源导入EGT合成基因，实现在大肠杆菌中合成EGT，并对大肠杆菌进行改造以达到更高的产量。Tanaka等利用之前构建的高产胱氨酸的大肠杆菌为出发菌株，异源表达耻垢分枝杆菌中的EgtABCDE基因，对改造后的菌株进行分批补料发酵，在不同的生长阶段采取不同的补料方式，最终在3 L发酵罐上培养216 h后使产量达到了1.311 g/L[22]，这是目前报道的微生物合成EGT的最高产量。
2 试验技术原理
菌种的优良性能是保障产品市场竞争力的核心，通过菌种选育，可以使菌株定向获得某种特性，提高菌株的经济价值。微生物菌种的选育通常包括五个方面：适应性进化育种、诱变育种、杂交育种、代谢控制育种以及基因工程育种[23]。
适应性进化又称定向进化，是一种微生物菌种改良技术，可以使菌株定向有目的地获得某种特性，并且对除目的表型外的其他优良性状影响较小[24]。普通的适用性进化一般需要传数十代，其过程繁琐且实验周期较长，试验采用全自动高通量微生物液滴培养仪(Microbial Microdroplet Culture system, MMC)进行菌株适应性进化。MMC可以大大缩短进化实验时间简化实验步骤，是当前最适合做适应性进化的仪器。
诱变育种是指用物理或化学因素诱导微生物，致使微生物基因发生随机突变，遗传特性发生变异，再从突变群体中筛选出目的性状优良的突变菌株，进而培育成新的品种的育种方法[25]，主要有化学诱变和物理诱变两种方式，化学诱变的作用机理是利用分子结构不稳定的诱变剂对DNA产生化学作用，主要是使碱基位置发生互换，进而致使基因损伤和修复错误，产生可遗传的变异[26]。
常压低温等离子体(Atmospheric and Room Temperature Plasma，ARTP)是近年来兴起的一种新型物理诱变技术[27]，指能够在大气压下产生温度在25-40°C之间的、具有高活性粒子（处于激发态的氦原子、氧原子、氮原子等）浓度的等离子体射流，可以穿透微生物细胞壁或细胞膜，损伤DNA分子，从而改变目标微生物的基因序列和代谢网络，发生不确定性突变[28]。
基因工程育种是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的过程，原理为基因重组[29]。研究证实，基因可以通过转入大肠杆菌来实现外源表达。
高通量筛选 (High throughput screening，HTS) 技术是指在分子水平和细胞水平的实验基础上利用自动化仪器操作系统进行实验操作，检测仪器收集实验数据并通过计算机分析处理数据，可以实现在同一时间检测处理数以千万的数据，HTS具有微量、快速、灵敏和准确等特点，是药物研发过程中很重要的一种技术[30]。
3 试验设计流程
3.1 适应性进化选育甲醇耐受菌株
以M.oryzae为出发菌株，利用全自动高通量微生物液滴培养仪中适应性进化模块对菌株进行耐受甲醇驯化，得到可以耐受40g/L甲醇浓度的耐受菌株M.oryzae-33。确定30 h为菌体液滴在全自动高通量微生物液滴培养仪中的传代时间，依次设置30、35、40、45 g/L的甲醇浓度，每个浓度连续传代4代。在甲醇浓度为45 g/L时，液滴生长受到较大抑制，说明该浓度已接近菌株耐受极限，此时将6个生长较优的液滴进行提取，在40g/L甲醇浓度下验证驯化菌株的生长状况，随后在40 g/L甲醇浓度下进行发酵验证其麦角硫因产量，通过筛选最终得到了一株可以在40g/L甲醇条件下生长且麦角硫因产量为12.37 mg/L较原始菌株提高35.9%的菌株(M.oryzae-33)[19]。
3.2 ARTP诱变育种选育EGT高产菌株
利用ARTP诱变方法对M.oryzae-33进行诱变，并建立可以高效快速地筛选麦角硫因高产突变菌株的高通量筛选方法。利用麦角硫因的抗氧化作用，选取50 mg/L的高锰酸钾作为初步筛选的条件，确立了麦角硫因浓度与254nm处吸收波长之间的线性关系，同时验证发酵培养基成分对254nm处麦角硫因的吸收波长无影响，并以此建立起诱变菌株的高通量筛选方法，即诱变菌株利用深孔板发酵处理后，通过酶标仪进行OD254检测，选取OD254高的进行摇瓶复筛。确立80s为ARTP诱变处理时间，通过ARTP诱变高通量筛选，最终得到一株麦角硫因产量较亲本提高37.5%的高产菌株 (M.oryzae-336)，并对其连续传代6代后验证EGT产量均稳定在16 mg/L左右，确定其具有遗传稳定性[19]。
3.3 发酵条件优化
根据M.oryzae的生长特性以及麦角硫因的合成特点，依次对发酵过程中的氮源、碳源、金属离子、微量元素等进行优化。通过摇瓶发酵验证得知，复合氮源、复合碳源以及Fe2+对麦角硫因的产量具有重要影响，得到最佳培养基条件为酵母浸粉2.5 g/L、氯化铵8 g/L、甲醇30 g/L、木糖8 g/L、硫代硫酸钠4 mg/L、硫酸亚铁4 mg/L、磷酸吡哆醛6 mg/L，原始菌株EGT产量达到23.9 mg/L较优化前EGT产量提高约4.5 倍。M.oryzae-336在优化后产量最高达到35.6 mg/L较同一条件下原始菌株EGT产量提高48.9%。随后又对5 L罐发酵条件进行验证，得到发酵的pH控制策略为控制初始pH值为7.0，后期自然下降至5.5后恒定控制在该水平。补料方式为甲醇浓度低于10 g/L 时，一次性补入甲醇10g/L，该补料方式下EGT产量较批发酵提高52.6%[19]。
3.4 大肠杆菌中外源构建EGT合成通路
在大肠杆菌中异源搭建麦角硫因合成路径。将M.oryzae中麦角硫因合成相关的5 个基因EgtABCDE依次构建到载体pET21上，并导入大肠杆菌BL21中。通过检测蛋白表达情况证实5个基因均可以在BL21中进行表达，LC-MS确定重组菌株中麦角硫因的存在，摇瓶发酵后检测发现麦角硫产量可达到20.6mg/L，较甲基杆菌原始菌株初始产量具有显著提高，侧面验证甲基杆菌中麦角硫因合成基因的催化能力显著[19]。
4 产业现状及发展前景
麦角硫因是一种天然的抗氧化剂，其优异的抗氧化性能吸引了大量科研人员对其进行深入研究，结果发现麦角硫因具有降低炎症反应、细胞保护、延缓衰老、调节机体代谢和预防多种疾病的发生等生物活性[31-35]。在食品领域中，EGT具有开发成为天然的食品抗氧化剂[36,37]、食品护色剂和膳食补充剂的潜力。基于麦角硫因强抗氧化性、稳定性高、无毒性的特点，使其在生物医疗领域具有良好的应用前景，可作用于糖尿病[38]、心血管疾病[39,40]、神经系统疾病[41]、肠道疾病[42]、肝脏疾病[43]、子痫前期[44]和肺损伤[45]等。在化妆品行业中，EGT具有一定的美白功效，能够抑制黑色素过度产生[46,47]和酪氨酸酶的活性[48]，避免色素形成和沉着，起到美白和提亮肤色的作用，EGT于2018年被列入欧盟新资源食品清单，其需求将稳定增长。
因此，EGT受到越来越多研究人员和产品开发人员的关注。研究表明只有少数细菌和真菌可体内合成EGT，植物、动物和人类自身均不能直接合成EGT，只能从其他来源获取。EGT可通过生物提取法、化学合成法以及生物合成法获得，但生物提取法存在提取效率低、耗费时间长、难以产业化等问题，化学合成法存在产品安全难以保证、原料成本高昂等缺点，难以满足EGT市场需求，因此借助基因工程、蛋白质工程和代谢工程等技术利用生物合成法生产EGT在缩短周期，增加产量方面具有广阔前景。
麦角硫因作为一种独特的氨基酸衍生物，在食品、化妆品和医疗等方面具有广泛应用前景，人们对其需求也不断增加，这就要求研究人员对EGT生产给予更多的投入。相信随着研究不断深入，各个瓶颈问题不断突破，EGT生产水平将会不断提高，满足市场的多方面需求，并将促进EGT在更多行业的应用开发。
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