优良葡萄酒酵母的选育及现状分析

摘 要：葡萄酒酵母是一种单细胞微生物,它可以把葡萄汁中的葡萄糖降解为乙醇和二氧化碳,在葡萄酒酿造过程中起着至关重要的作用。优良的葡萄酒酵母具有生长速率快、耐高渗透压、耐SO2、发酵平稳、酒精产率高、发酵完全等特性。同时,葡萄酒酵母的发酵性能也对葡萄酒的风味、酒精浓度等有着重要影响。因此,优良葡萄酒酵母的选育及其发酵性能的研究,对葡萄酒酿造行业至关重要。酵母菌株选择和基因工程技术已经彻底改变了葡萄酒酿造行业，为提高发酵过程、提高葡萄酒质量和多样化风味提供了新的解决方案。本文探讨了酵母遗传选择技术对葡萄酒行业发展的影响，重点介绍了该领域的进展、挑战和潜在的未来方向。

  关键词：葡萄酒酵母；杂交育种；发酵性能

第一章     葡萄酒

葡萄酒是一类以葡萄为原料发酵的酒类饮品,发酵过程简易,原料容易获得,属于人类最早的酿造酒之一。早在周朝,《周礼》一书中便有葡萄的记载,并把它列为珍果之属。东汉时期,张骞出使西域,将葡萄品种以及葡萄酒的相关技艺带到了中国,从此我国也开始有了饮用葡萄酒的习惯。1892年,山东省烟台市张裕葡萄酿酒公司的创建标志着中国走向工业化生产葡萄酒的时代大道。自上海张裕葡萄酿酒企业建立以后,在中国北京、通化等地方的葡萄酒厂也相继成立,我国葡萄酒产业取得了飞速的发展,同时也实现了对外出口,走向世界。

根据国际葡萄与葡萄酒组织的规定 (OIV2003) 葡萄酒只能是破碎或未破碎的新鲜葡萄果实或葡萄汁, 经完全或部分酒精发酵后转化为酒精度不低于7度的 (v/v) 另一种生物产品。

近年来, 随着人类健康意识的增强, 使酒的营养卫生问题愈来愈被人们重视, 而葡萄酒酒度低、营养高, 饮量适度有益脑保健, 因此葡萄酒饮用者也越来越多, 它也成为我国人民餐桌上、庆典上必不可少的酒水。葡萄酒是惟一的碱性酒精性饮品, 可以中和现代人每天吃下的大鱼大肉以及米面类的酸性食物, 降低血液中的不良胆固醇, 促进消化, 因此葡萄酒不再是一种单纯的饮品, 如英国医生在为患者开的治疗方案中就包括饮葡萄酒。2002年, 美国《时代》周刊刊登的10种有益的健康食品中就有葡萄酒。美国政府还允许在国产的葡萄酒标签上写“适量饮酒健康”的提示。葡萄酒产品的种类繁多, 从颜色上分:有红葡萄酒 (由红葡萄带皮发酵而成) 、白葡萄酒 (由白葡萄酿制而成或红葡萄去皮酿制而成) 和桃红葡萄酒 (由红葡萄酿制而成, 但果汁与果皮混合在一起浸泡的时间较短, 因此颜色较浅) 3类;从含糖高低分:有干酒、半干酒、半甜酒和甜酒4种。葡萄酒味道甘甜醇美, 营养丰富, 它除了含有葡萄果实的营养外, 还有发酵过程中产生的有益成分。

第二章     酿酒酵母

酿酒酵母所属真菌界(Fungi)-子囊菌门(Ascomycota)-半子囊菌纲(Hemiascomycetes)-酵母目(Saccharomycetales)-酵母科(Saccharomycetaceae)-酵母属(Saccharomyces)-酿酒酵母种(Scerevisiae)。葡萄中的糖分,经酵母发酵产生乙醇和二氧化碳,以及其他的产物,使葡萄酒具有不同颜色、口感。酿酒酵母的差异对酒的品质影响深远。

2.1 酿酒酵母的基本特征

酿酒酵母一般呈圆形、卵形或椭圆形，其宽度为2.5～10.0μm，长度为4.5～21.0μm。细胞无真菌丝并通过重复出芽繁殖，有些细胞发育为含1～4个孢子的子囊。与细菌细胞相比，酿酒酵母细胞较大，生长周期短、发酵能力强。酿酒酵母是兼性厌氧微生物，尽管它可以在微氧条件下生存，但氧气是维持酵母细胞活性的重要因素，在供氧不足的条件下，增殖减速，其代谢产物也会发生改变，酿酒酵母生长的最适pH为4.5～7.0，但大多数情况下在pH为3.0的环境下仍能生长，，最适生长温度为28～30℃，其次，酿酒酵母具有耐酸性强，、生长迅速、代谢繁殖快、易培养等优点，并且其基因组信息已知、遗传操作简便、具有真核生物对蛋白质翻译后加工和修饰的特性，早在1996年，酿酒酵母的全基因测序已全部完成，是第1个基因组测序完成的真核生物，酿酒酵母基因组总共大约编码6 100个基因，目前，已通过基因敲除技术完成96%己知基因的功能解析，也是第1个可用于外源基因表达的真核生物。

2.2葡萄酒中酿酒酵母的代谢

在葡萄汁中,酵母菌对含氮化合物的有3条代谢途径分别为:一是在生物合成中被直接利用,二是转为生物合成所需的化合物,三是经过氨基作用使含氮化合物释放游离态的铵离子或结合氮。葡萄液中的主要含氮化合物还有精氨酸、脯氨酸、亮氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、色氨酸和丝氨酸。NH4+、谷氨酸和谷氨酰胺能被酵母优先利用。葡萄酒酵母菌的代谢途径大致分为:糖代谢、苹果酸代谢、氮代谢和硫代谢。糖代谢就是酿酒酵母产生酒精的过程,主要通过以下途径:通过糖酵解把培养基中的糖分变成丙酮酸,通过还原反应加入乙醇脱氢酶,让乙醛反应生成乙醇。葡萄汁中的大部分糖在酵母菌生长过程中被使用生成乙醇、二氧化碳,并在过程中产生热量,少部分糖则在发酵代谢中被转化为其他副产物。发酵产生的代谢副产物如絮状物等不仅会影响葡萄酒的感官品质,而且也会产生少量毒素对发酵产生影响。苹果酸代谢即葡萄酒中苹果酸被菌群分解的过程,其中小部分苹果酸被酵母菌分解,酵母菌中苹果酸代谢与糖代谢类似,最后产生酒精;大部分苹果酸则被乳酸菌分解为乳酸和二氧化碳。硫代谢过程是指通过还原作用先硫酸盐变成亚硫酸盐,然后继续还原成H2S,再参与其他硫化物的合成。硫代谢是酵母生长中的重要代谢途径,是维持存活的保障,但在发酵中含硫化合物过多存在,会导致葡萄酒存在异味,硫化物会与酒内其他物质反应形成絮状物,导致葡萄酒风味劣化。因此,许多公司致力于筛选低产硫化物酵母菌。

2.3酿酒酵母的葡萄酒发酵

生产葡萄酒的关键在于对于酿酒酵母发酵过程的管控,除了酵母生长繁殖所需的碳源、氮源、维生素以及矿物质,还需要适宜的温度、酸度、酒精含量、接种量等。葡萄果皮、葡萄籽中的单宁是一种抗氧化剂,可使酒体清亮且有光泽,同时也能协调酒体使之饱满。酵母细胞壁提取的酵母甘露糖蛋白,可使葡萄酒香气馥郁协调,改善涩味。

苹果酸-乳酸发酵是葡萄酒发酵中的特殊工艺,在该阶段中,苹果酸被乳酸菌分解为乳酸和二氧化碳。经该种发酵方法后,葡萄酒的絮状物含量下降,滋味协调,酒液清亮,葡萄酒品质提高。其中菌株球菌属、明串珠菌属、乳杆菌属等对二氧化硫、酒精、乙醇有良好的耐受性。目前,生产上普遍采用接种乳酸菌的方式启动苹果酸-乳酸发酵。乳酸菌中的裂解蛋白酶、果胶酯酶、半乳聚糖醛酶等统称为果胶酶,功能在于使葡萄的大分子降解为小分子结构以及使细胞壁上的果胶被果胶酶所水解,从而加快了胞内产物的释出。同时,果胶酶还能改善酒体,分解浑浊物与絮状物,提高酒液亮度.

三、葡萄酒酵母的选育

酵母形态分为圆形、卵形与椭圆形,其营养体以单倍体或二倍体细胞存在,通过出芽方式繁殖,一定条件下进行有性繁殖,酵母在自然界中广泛存在,其选育技术主要包括:自然选择、诱变性选育、杂交育种、原生质融合选育、分子生物学育种等。

3.1自然选育

自然选育是指在自然环境下无人为干预微生物自发性突变。自然界中存在许多突变诱发物,如:紫外线、辐射、高温、土壤酸碱性、湿度等,他们能诱导微生物产生突变。葡萄成熟时,果皮容易出现裂缝,渗透汁液,为酵母菌的滋生繁衍创造环境。而周围土壤中的酵母则是葡萄果实熟透掉落后进入的,并使用熟透的葡萄中养分与土壤中的微量元素大量繁殖。因此,土壤是酵母离开葡萄后另一个适宜的生长场所。在一般的葡萄和葡萄酒产区,由于菌群的对自然条件的适应,当地的环境因素如温度、湿度、土壤微量元素和葡萄种类会进化出多种酿酒酵母菌株。而新建葡萄园或是种植葡萄较少的地区,由于葡萄种类单一或者种植面积不够,其周边土壤中的酵母菌类别单一,菌种繁育情况较差。所以在筛选育种中,选择年代跨度长的葡萄园区为酵母菌筛选来源。此外,发酵醪中也存在着大量酵母菌,由于酵母菌必须要适应发酵醪中的胁迫环境方能生存,因而筛选的酵母菌更具有优势,选育可行性也更高。另外,葡萄酒生产企业所使用的设备、保存葡萄酒的容器、存储的酒窖周边,甚至运送葡萄的车辆、经过的路面、以及周围区域的排水管道等都是酵母菌的生存场所,故也可以在葡萄酒厂周边筛选酵母菌。

战景娟等采用山葡萄作为对象,对其进行分离,纯化,培养,发酵,分析,得到一株低温耐性高、高酸度耐性的酵母菌,利用其发酵酿制的葡萄酒,有特殊的优良风味。他们分别在不同采收期对山葡萄进行采收，从中分离酵母。经数次选育试验结果证明.从霜后采收的山葡萄中分离出的酵母较好.将霜后成熟的山葡萄果粒经处理放入培养基中，在室温下进行厌氧培，再用稀释分离法挑选单细胞菌株培养。

将培养后获得的酵母菌株与葡萄酵母菌株进行对比发酵。对所得葡萄酒进行理化指标的分析，结果如下

由数据可知，长白8号酵母发酵的山葡萄原酒的总氮，总黄酮，总酚和干浸出物均高出通化地区用普通酵母发酵的山葡萄原酒。铵盐，氨基酸和肽蛋白质及核酸类物质是葡萄中主要含氮化合物。据报道，总氮中90%为游离氨基酸，氨基酸是葡萄酒风味物质和营养的重要组成部分。而葡萄酒中酚类物质主要有酚酸类、黄酮、单宁多聚体。花色苷、酚类物质赋予葡萄酒一定的颜色，使葡萄酒呈现特殊的苦涩味。酚类物质决定葡萄酒的口感与典型性，酚类物质与红葡萄酒的营养价值有关。由以上说明可以看出，用长白8号酵母发酵的山葡萄原酒所含的营养成分决定了其酒香浓馥、酒体协调。该酒经品尝，感官指标和口感均好于普通酵母发酵的山葡萄原酒。

3.2诱变选育

诱变选育是指通过物理或化学手段引起动、植物的基因功能产生变化,获得某个符合特定要求,从而被人们扩大培育或者应用于工业生产的变异种群。紫外线诱变是微生物选育的常用方法,该方法可以大幅度提高酵母菌基因突变的概率。曹礼等[14]使用葡萄鲜果为原始材料,分离纯化出野生酿酒酵母菌,并采用紫外诱变方式,共得到了七株突变株,经过分离纯化,并对其发酵特性包括含酒精量和残糖量进行分析,最终筛选到一株发酵速度快、残糖量低、含酒精多的酿酒酵母突变株。但由于基因突变是随机的,要想得到定向的诱变菌株,需要花费巨大工作量,其时间与资源消耗也是巨大的,最后也难以达到预期的成果,付出与收获不成正比。所以,合适的筛选方法同样重要。

3.3杂交育种

杂交育种是指群体或基因型不同的个体间进行杂交,并从其杂交子辈中筛选来培育纯合子的技术。有性杂交是酵母杂交育种中常采用的方式,通过产生二个截然不同结合类型的单倍体菌株的子囊芽孢,实现有性杂交。杂交育种是选择已知优势特性的供体、受体作亲本,可以有效的解决菌株生产特性无法改善的困难,尤其是针对进行诱变处理的菌株。杂交培育技术在控制基因特异性表达与方向性有不少进步。但因为该技术操作繁复,这种技术的方向性和目的性都很强,比诱变育种技术有了长足的提高。但是因为杂交育种的技术比较复杂,而且相关研究不够完善,会出现育种性状分离的情况,所以不像诱变育种技术一样获得大面积的普及和使用。

酵母的杂交方法有孢子杂交法、罕见交配法以及原生质体融合法。

3.3.1孢子杂交

孢子杂交是酵母最常见的杂交方式，属于酵母有性繁殖，通过形成单倍体的子囊孢子的方式进行。孢子是有两种交配类型(a型或α型)的单倍体细胞，不同的交配型可以在萌发后进行接合，形成二倍体菌株。孢子杂交现在一般有两种方式，一种在显微操纵器下，可以将两个亲本菌株的孢子相邻地放置在琼脂平板上进行精确的孢子与孢子交配，另一种将大量孢子随机混合在固体或液体生长培养基上，即大量交配.孢子杂交的方法应用广泛,其优点为杂交效率高、不需要基因标记以及后代的基因组稳定性高。但这种方法适用于能够高效产生孢子的菌株，而且在大量交配时需要用到选择性标记。分离出的杂交体可以通过各种PCR(例如ITS、Interdelta或特异性引物)或核型技术(例如脉冲场凝胶电泳)来确认.

3.3.2罕见杂交

如果亲本菌株中有一个或两个不能形成可存活的孢子，可以采用罕见交配。二倍体(或更高倍性)菌株通常有a/α杂交交配型(即杂合交配型位点)，不直接交配。然而，存在一种的频率很低(10-4)交配型基因座杂合性自发消失现象，导致a/a型α/α型交配型二倍体(或更高)细胞的形成。这些细胞可以交配形成多倍体杂交，其中可能包含或多或少双亲菌株的全部基因组。这些最新的研究表明，通过罕见交配产生的高倍性啤酒杂交种比通过孢子对孢子交配产生的二倍体啤酒杂交种表现更好(在发酵速率和香气形成方面)。然而，正如其名字所暗示的，这些交配很少发生，杂交频率通常很低。此外，由于交配频率低，需要选择标记(如营养缺陷型、抗生素)来从亲本细胞群体中分离杂种。罕见交配形成的杂种基因组也往往不如孢子交配形成的基因组稳定.威斯康辛大学Peris等人发明了一种高效的罕见杂交方式，通过在亲本中转入不同抗性的质粒，质粒在抗生素的诱导下表达HO基因，改变其交配型，再将两个亲本的孢子共同培养在两种抗性的平板上，选出的杂交株在没有抗生素的环境中，质粒可以丢失，从而得到非GMO的菌株。

3.3.3原生质体融合

酵母杂交的最后一种方法是原生质体融合。首先消化亲本菌株的细胞壁(即形成原生质体)，然后将细胞或原生质体聚集在一起并进行融合，接着是细胞壁的再生。与罕见交配一样，这种技术对交配很少形成可存活孢子的菌株特别有利。此外，原生质体融合允许有性不相容的细胞进行交配，例如，形成属间杂交。原生质体融合的缺点是杂交频率低，需要选择标记，和典型的低基因组稳定性的杂交。此外，原生质体融合产生的杂种在世界某些地区可能被认为是转基因的,也存在一定的风险。

四、前景与展望

优良葡萄酒酵母的选育及其发酵性能研究对促进葡糖酒产业提档升级有着重要的现实意义。优良葡萄酒酵母培育“本土化、国产化”任重道远。因此,加大本土酵母自主研究力度,用好本土酵母资源,培养更多不同菌株,在葡萄酒酿造过程中考虑与分泌酶类、产酯类、甘油和香气成分相关的有孢汉逊酵母等非酿酒酵母共发酵,改进我国葡萄酒的工业生产技术,以期筛选出最优良的葡萄酒酵母菌株,不断夯实我国葡萄酒产业理论基础,实现以提升酵母品质“小切口”推动我国葡萄酒产业“大变化”的目的。

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