生物工程技术在制备高纯度多糖中的应用

摘 要：随着现代医学和生物技术的发展，多糖因其多样的生物学功能而受到极大关注。它们不仅在细胞生物学过程中发挥重要作用，还因其抗肿瘤、免疫调节等药理效果而在食品和医药产业中显现出巨大应用潜力。目前，高纯度多糖的制备成为制约其工业化生产和广泛应用的瓶颈。本文探讨了运用生物工程技术，尤其是利用工程菌在多糖的生产、提取和纯化过程中的应用，并分析其在生产过程中的效能和优势。文章首先介绍了多糖的基本特性、功能以及在传统生产方式中存在的不足。继而通过案例分析，阐述了选择特定多糖通过工程菌发酵生产的优越性，并详细介绍了工程菌构建和下游处理的技术流程。最后，对生物工程在未来多糖生产中的趋势和可能面临的挑战进行了展望。

关键词：生物工程；工程菌；提取纯化；多糖

1引言

多糖是一类在自然界中广泛存在的大分子生物聚合物，由10个以上的单糖通过糖苷键组成，它们在植物、微生物、藻类和动物中普遍存在。多糖在生命活动中扮演着不可或缺的角色，如细胞间通讯、细胞粘附、免疫系统分子识别等领域。近年来，源自自然资源的多糖因其抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、抗炎等药理活性受到了广泛关注。现阶段多糖已大规模应用于普通食品及保健食品及医药行业。尽管如此，目前的多糖生产方法，特别是工业化生产手段，在高纯度和大规模制备方面仍存在一定的局限性。因此急需开发新型提取、纯化手段。在全球范围内，因健康食品和药品市场的快速扩张，多糖的应用前景日益广阔。现阶段多糖工业生产多为非生物的传统提取、纯化方式，如热水或化学溶剂提取、酶促提取、超声波辅助提取、微波辅助提取、高压辅助提取、膜分离技术、酒精沉淀、凝胶过滤等。这些传统非生物方法往往存在产量低下、耗时耗能、难以达到高纯度或是成本高昂等问题，很难满足日益严格的质量控制标准和环保要求。[1,2]

面对这一挑战，现代生物工程技术提供了一种有效的解决方案。通过基因工程和代谢工程手段，设计和构建高效的工程菌，使之能在控制的发酵环境中大量生产目标多糖或是精准消耗某种多糖进而提高目标多糖的纯度。这一方法不仅提高了生产效率和多糖的纯度，还降低了生产成本和环境影响。工程菌的选育与优化、发酵过程的控制技术以及下游提取纯化技术的不断进步，正在加速多糖从实验室到工业化生产的转变。[3]尽管生物工程技术在多糖生产中展现出巨大的潜力和优势，但目前在其应用实践中仍存在若干技术障碍和挑战。基础菌株的选择、产量及活性稳定性的维持、生产过程的优化、产物质量的控制以及成本效益的平衡等，成为制约发酵生产多糖产业化发展的关键因素。在工程菌的构建与发酵过程中，如何有效调控代谢途径、提高目标多糖的合成效率和纯度，以及如何简化和改进下游提取纯化工艺，是现阶段科研工作者和技术开发人员所关注的焦点[4,5]。本人硕士课题研究方向为通过对工程菌进行基因改造，进而使其拥有专一消耗某一种多糖的能力，以此来达到纯化目标多糖的目的。

因此本文将围绕生物工程领域中对植物多糖制备技术的运用展开详细讨论。首先，采用案例分析方法，以某些具有明确生物学功能和市场应用价值的多糖为例，探讨利用工程菌生产多糖的原理与优势。接着，分析工程菌构建的具体方法及其在提高多糖生产效率和纯度方面的作用。此外，还将简单讨论多糖生产过程中的下游处理技术，重点关注提纯步骤中的现阶段发展状况及技术创新和挑战。最后，文章将展望生物工程技术在未来多糖生产领域的应用前景，并讨论可能遇到的问题与解决策略。

2工程菌构建的方式

2.1 随机诱变

随机诱变属于生物工程技术中的一种方法。它是指通过化学物质、辐射等诱变剂对生物体的遗传物质进行随机改变，从而产生遗传变异。这些变异可能会在生物体的表型上产生新的特性，这是遗传工程中常见的一种手段。通过随机诱变产生的变异个体，可以用来研究基因功能或是培育出具有新特性的生物品种。

在构建高产普鲁兰多糖的工程菌过程中，李熙文[6]突破了生产瓶颈，通过随机诱变技术和筛选适应性进化，培养出了工程菌株M233。这一菌株能以100克/升葡萄糖为原料，高效生产出61.3克/升普鲁兰，显示出其强大的生物转换能力和巨大的商业化潜力。为了提高菌株的耐受性并优化生产条件，研究人员在50%葡萄糖浓度的平板上进行连续传代培养，筛选出耐高渗透压的进化工程菌株M233-20。这一菌株在80%至90%的高葡萄糖浓度培养基中仍能生长，为工业级生产普鲁兰奠定了基础。此外，酶活性的显著增强和基因表达的改进，以及添加无机盐等工艺改良，如轻质碳酸钙，不仅提高了普鲁兰的产量，还显著增加了其分子量。这些研究成果不仅提升了普鲁兰的产量和品质，还证明了随机诱变与适应性进化策略在培育高效工程菌方面的有效性。结合代谢工程和合成生物学的方法，实现了对多糖生产关键生物学性能的精确调控，为多糖产业的可持续发展和规模化生产开辟了新的途径。

2.2基因编辑技术

CRISPR-Cas9技术作为一种突破性的基因编辑工具，旨在以前所未有的精准度对生物基因进行调整和重塑。简而言之，CRISPR部分由细菌DNA中的重复序列组成，其功能在于指导Cas9——一种能够在DNA上作出切割的酶——准确找到并剪切目标基因序列。通过设计特定的导向RNA（gRNA）来指导Cas9定位到基因组的特定位点，然后Cas9酶执行其切割任务，创造DNA断裂，随后借由细胞本身的修复机制引入修改或是插入新的基因片段。得益于其高效、简便、成本效益高和适用范围广等优点，这项技术在基因治疗、农业和微生物生产等领域崭露头角，宣告着未来生物技术发展的新纪元。尽管CRISPR-Cas9在实施过程中存在一定的非特异性编辑风险，但随着技术的不断成熟与完善，其在生物医学和生物工程领域中的应用潜力不容小觑，标志着人类对生命科学深入探索的又一次飞跃。

CRISPR-Cas9技术在工程菌的开发中扮演了关键角色，它通过代谢工程改造微生物基因组，设计出最优化的微生物细胞工厂。具体操作包括过表达、敲除或敲减关键基因，以此实现改变工程菌代谢通路的目的。在过去几年里，CRISPR-Cas9已被广泛应用于修改各类基因工程菌株，以便生产大量的目标产品。研究人员以实现高效发酵产量和提高菌株生产力为目标，已经利用CRISPR-Cas9技术创建了能够耐受低pH值、温度变化和各种抑制剂的强健菌株。该技术的应用使得微生物细胞工厂能够通过组合多种代谢工程组件，高效且环保地合成目标化合物和医药中间体。[7]

在植物多糖制备技术方面，基因编辑技术的应用潜力极大。研究人员可以设计特定的微生物菌株，通过基因编辑手段在微生物中集成一组性能优化的多糖酶，从而提高它们的产量和纯度，降低产物的生产成本。通过这种方式，可以构建出更适合工业规模生产多糖的工程菌。

比如，对Trichoderma reesei进行基因编辑[8]，改变其多糖酶基因的表达调控，从而使得在便宜的碳源条件下（如葡萄糖）也能够有效地生产出高活性的多糖酶。这就需要对碳源调节的负反馈机制（如CCR，碳源分解抗性）进行改造，使得即便在有碳源存在的条件下，多糖酶的表达也不会受到抑制。专利文献中提到的研究成果展示了通过对调控基因（如XYR1）的改造，已经实现了这种无需诱导剂的多糖酶持续生产的目标。(Liu)

随着CRISPR-Cas9及其它复杂基因编辑技术的发展，预计在生产多糖等大宗化学品的工程菌中，CRISPR-Cas9将继续发挥其重要作用，推动目标产品生产效率的进一步提升。

3生物分离工程

3.1膜过滤技术

膜过滤技术在多糖的纯化过程中扮演着关键角色。其操作简单、效率高、可连续化生产，且理想情况下对目标产物伤害较小，这些特点使得膜过滤成为多糖下游处理中不可或缺的一部分。常用的膜过滤技术包括超滤（UF）、纳滤（NF）、反渗透（RO）和微滤（MF）。

超滤膜用于分离相对较大的分子，例如蛋白质和多糖，而较小的溶质如盐和单糖则可以通过。纳滤膜相对于超滤膜的孔径更小，可以用于分离相对分子质量较小的多糖和其他有机物。反渗透则主要用于除去溶液中的离子和非常小的有机物。微滤具有更大的孔径，适合于除去悬浮颗粒和较大的细胞碎片等。

在实际应用中，通常会根据多糖的特性选择合适的膜过滤工艺。例如，通过使用不同孔径的UF和NF膜，可以按照多糖分子的大小进行分级，并有效移除低分子量的杂质。膜材料的选择也是一个重要的考虑因素，因为不同材料的膜对化学和热稳定性、抗污染能力以及选择性有着不同的表现。

此外，膜过滤过程中的操作条件如压力、温度和pH值等对分离效果有着显著影响。因此，对膜过滤参数的优化，可以有助于提高多糖的收率和纯度，同时降低能耗和运营成本。

然而，膜过滤技术也存在某些局限。膜的堵塞和污染可能会随着时间的推移导致膜效率的降低，因此需要定期的清洗或更换。在某些情况下，这一问题可以通过预处理步骤来减轻，比如利用微滤去除较大的颗粒以保护后续的超滤或纳滤膜。

为了实现多糖的高度纯化，膜过滤经常与其他下游技术如离心、絮凝、色谱等联合使用。这种多步骤的组合方法允许更加精确地控制纯化过程，减少不同杂质的干扰，并最终获得高质量的多糖产品。随着膜技术的进步和对过程控制的深入理解，膜过滤在多糖生产中的应用势必会越来越广泛，能够满足日益严格的工业和医药标准。

3.2离心技术

离心技术是一种利用离心力将混合物中的颗粒或分子依据其质量或密度差异进行分离的方法。在生物工程中，离心通常用于分离细胞、细胞器、大分子或其他颗粒。在多糖的下游处理中，离心技术能有效地从发酵液中移除微生物细胞、细胞碎片以及其他大分子杂质，进而获取较高纯度的多糖。

常用的离心设备有管式离心机、盘式离心机和超速离心机等。通过调整离心力的大小（即离心加速度或G值）和离心时间，实验者可以优化分离条件，确保目标多糖以较好的收率和纯度被分离出来。此外，通过改变溶液的pH值或离心温度，也可以提高离心过程的效率和选择性。

对于生产规模较大的工业应用，连续式离心机的使用更为普遍。这类设备可以处理较大体积的混合物，并且支持连续操作，这意味着原料可以不断输入，分离出的纯化物和残余物可以实时收集。该技术在提高生产效率和减少操作时间方面尤为有效。

尽管离心技术在多糖分离中被广泛应用，但它也有一些局限。例如，离心过程可能导致一部分多糖破碎，影响其分子结构和生物活性；也可能因为高速运转造成设备的磨损和能耗问题。因此，在设计多糖生产的下游处理工艺时，需权衡不同分离技术的优势与限制，综合考量经济性、效率、处理量及产品质量等因素，制定最佳的生产策略。

3.3色谱技术

色谱技术是另一种在多糖纯化过程中经常使用的分离技术。利用固定相（色谱床层）与移动相（溶剂）对不同化合物的分配系数差异，色谱技术可以实现化合物的有效分离。对于多糖而言，最常用的色谱技术为凝胶渗透色谱（GPC），也称为尺寸排除色谱（SEC）。GPC允许基于分子大小的分离，较小分子会因为更频繁地进入凝胶颗粒的多孔结构而在色谱柱中移动缓慢，而较大分子则因为无法进入孔而快速通过柱体。

除了GPC，离子交换色谱和亲和色谱也是多糖纯化中常见的色谱方法。离子交换色谱分离原理是根据多糖分子上的电荷差异进行分离，而亲和色谱则是通过多糖与某些特定配体的结合亲和力的差异来实现分离。亲和色谱常用于提纯具有特定结构或功能的生物活性多糖。

色谱技术可以提供高分辨率的分离效果，但操作成本较高，处理量较小，通常不适用于初步粗分离，而是作为最终纯化步骤。通过综合应用包括膜过滤、离心以及色谱技术等多种下游处理方法，可以达到从复杂生物体系中高效、高纯度提取多糖的目的。在实际生产中，工艺优化和创新不断推动多糖纯化技术的发展，为获取更高质量的多糖产品提供了可靠的解决方案。

以上分离技术均为利用物理手段进行分离，最终达到纯化目标产物的目的，是现阶段工业分离的常用方式，但其存在耗能高、成本高的缺点，后续仍需研发新型的分离纯化手段。

4展望

想要构建某一种应用于生产某一物质的工程菌并将其应用于实际生产时，基本遵循以下几个步骤：1.寻找以目标产物为代谢产物的菌种。2.分析该菌种体内的代谢通路，并结合代谢工程对此代谢通路进行干预，即通过随机诱变或基因编辑技术改变目标基因，提高代谢通路内目标产物的前体物质的表达或抑制目标产物的代谢，甚至直接改变代谢通路，使工程菌用另一种代谢途径生产目标产物。以此来提高目标产物的产量。3.对工程菌进行生产测试，探究其在大规模生产中的发酵条件。4.设计下游工艺，对目标产物进行分离。除此之外，在对工程菌进行基因编辑的过程中，可以加入一类能够通过生产中控制外界发酵条件来控制代谢通路的基因，以达到对生产的精准控制。

在下游工艺使用工程菌辅助纯化也是一个可以深入研究的方向。现阶段然而现阶段无论使用何种制备工程菌的方式，均是以提高目标产物的产量为目的，很少有文献报道使用工程菌对产物进行纯化的案例。无论上游获得产品方式为传统提取手段，还是通过生物工程手段生产的目标产物，均可通过工程菌对上游产物进行专一发酵进而纯化目标产物。除此之外，最理想的情况为获得两个或多个协同培养菌种，共同发酵，A菌为主力发酵菌，其副产物可以被B菌利用，产生目标产物或无副产物。最后得到高纯度目标产品。

自动化生产也是一个需要面临的挑战，现阶段大多数发酵均为间歇性生产，对产品按照批次处理，在某一发酵罐完成发酵后才能够进入下一阶段。以下提出两种可能的连续生产方式：第一种方式可以采用固定菌体方式，将菌体固定在某一可以快速更换的载体上，使液体原料可以缓慢流经这一载体，在流动过程中对产品进行发酵，并及时更换活力下降的附有菌的载体。第二种方式可以使发酵液流动，使用能够连续工作的分离设备，如膜过滤设备或是可以边进料边离心的离心设备，将菌分离出来送回至发酵工艺阶段，完成菌种的重复利用。这两种均可在一定程度上完成连续生产，但是自动化生产还需要自动监测功能，对如菌的生长状态、温度、物料浓度等进行监测，需要使用具备相应功能的检测器进行检测，并对数据实时监控分析。在检测菌生长状态时可以使用显微镜加机器视觉对菌的数量进行检测，以获取实时数据，以便对生产参数进行调整。

生物工程是为了提高生产效率而发展的工程技术，是人类改变世界的直接体现，它使得生物制造成为可能，使人类能够创造符合人类预期的生物，帮助人类进行生产。总之，生物工程技术正在加速人类对自然界的理解和利用，这不仅是科技进步的产物，也是人类智慧的结晶，它将继续推动人类社会和自然环境的和谐共生。

参考文献

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[2] WANG K ping, ZHANG Q lin, LIU Y, 等. Structure and Inducing Tumor Cell Apoptosis Activity of Polysaccharides Isolated from Lentinus edodes[J/OL]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2013, 61(41): 9849-9858. DOI:10.1021/jf403291w.

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[8] LIU G, QU Y. Integrated engineering of enzymes and microorganisms for improving the efficiency of industrial lignocellulose deconstruction[J/OL]. Engineering Microbiology, 2021, 1: 100005. DOI:10.1016/j.engmic.2021.100005.